經(jīng)典品讀匯 | 《豬病學》第11版之“經(jīng)典豬瘟”篇（下）
豬瘟病毒檢測
根據(jù)毒株毒力、檢測方法和樣本，CSFV一般可在感染后24小時內檢測出來(Liu et al. 2011)。病毒可以從加有肝素或EDTA的全血、血清血漿和血沉層中分離。最有可能富含CSFV的組織有扁桃體、脾臟、腎臟、回盲淋巴組織和咽喉淋巴結。
盡管病毒分離是確認病毒感染的重要參考方法，但耗時費力，不適合控制病毒進一步傳播的快速反應需求。使用病毒分離的目的是分離毒株，對病毒特性進行鑒定以便于疫苗的進一步研究。CSFV可用豬腎細胞系(PK15或SK6 )進行分離，關鍵是所用的細胞、培養(yǎng)基和試劑都要確保沒有瘟病毒及抗體存在。
qRT-PCR是目前較好的檢測病毒RNA的方法。這些方法具有高敏感性（診斷和分析）和特異性，特別是探針法(Hoffmann et al.2005, 2011; Le Potier et al.2006)。很多CSFV特異性qRT-PCR試劑盒已經(jīng)商業(yè)化。操作步驟都是特為檢 C 株活病毒基因組設計的，還可以同時檢測 CSFV 和 ASFV 基因組的試劑盒(Haines et al.2013)。
qRT-PCR可用于多種樣品CSFV感染的檢測，但主要是全血、棉拭子和組織樣品。此外，血清、血漿和白細胞也可以。用于病毒分離的樣品包括扁桃體、脾臟、回腸和淋巴結，但腎臟組織可能敏感性較差。
高質量的新鮮樣品最好，病毒RNA可存在于滅活組織中，病毒分離可能會因組織自融等原因未分離到。例如來自野豬的樣品（Petrov 等 2014）。病毒RNA可以長時間在一些組織中檢測到（例如可以在至少康復9周的豬扁桃體中檢測到病毒RNA）(Blome et al.2006)。
利用qRT-PCR方法擴增病毒基因組片段，可以區(qū)分CSFV、BVDV、BDV甚至CSFV不同毒株(Zhang et al.2012)。根據(jù)疫苗和被檢測樣品，qRT-PCR可以用DIVA方法檢測（可區(qū)分野毒株和疫苗毒株）。最近研發(fā)的C株特異性qRT-PCR試劑盒可以用于檢測免疫弱毒疫苗的動物，但是檢測到陽性結果不能排除野毒感染的可能性。特異性區(qū)別野毒和疫苗毒的PCR方法(Liu et al.2009; Zhao et al.2008) 可以檢測或排除野毒感染(Blome et al.2011)。
高度敏感的qRT-PCR可用于混合樣品的檢測(Depner et al.2007; Le Dimna et al.2008)，這樣可以顯著提高檢測量。但也有其它方面的考慮，包括準備混合樣品的時間，重新檢測單個陽性樣品所需要時間。為了避免敏感性降低，需要掌握操作方法的詳細資料，并對RNA水平進行檢測，在混合樣品前還需要比較臨床病例和免疫豬群的特點。
通常情況下，qRT-PCR檢測結果為陰性通常認為未感染，但檢測結果為陽性并不意味著動物感染了CSFV(Haegeman et al.2006)。
抗原捕獲ELISA被用于活豬早期CSFV感染的診斷；雙夾心ELISA是針對多種病毒抗原的單抗或者多抗為基礎的檢測方法，血清、血漿及血沉棕黃層、加入肝素或EDTA及組織勻漿都可以采用這些方法檢測。這些方法操作簡單，也不需要組織培養(yǎng)設備，操作簡單，并在36小時內出結果(Depner et al.1995)，但也要認識到抗原捕獲ELISA的局限性。目前所用的商業(yè)化試劑盒敏感性都比細胞VI低(Blome et al.2006)。另外，這些方法檢測仔豬血清樣品的敏感性要比來自成年母豬或者亞臨床癥狀和輕微癥狀的豬要高(Anonymous，2002)。為了彌補檢測方法敏感性的不足，所有表現(xiàn)異常的豬群都要檢測。這些方法特異性較差，并會出現(xiàn)假陽性結果，因此，抗原捕獲ELISA僅用于有臨床癥狀或符合豬瘟病變和監(jiān)測近期疑似感染的豬群。
盡管FAT能用于冰凍切片病毒抗原的檢測，敏感性高，可批量檢測，但該方法很快被qRT-PCR代替，可用于將來豬瘟爆發(fā)時的檢測。
豬瘟抗體檢測
病毒中和試驗（VN）是檢測CSFV特異性抗體的參考方法。CSFV中和抗體水平可用血清終點滴定法測定。但是VN要求高質量血清及細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。因為VN法通常需要 3-5 天時間才能出結果，因此不適合常規(guī)大規(guī)模測定。
由于不同瘟病毒間存在抗體交叉反應，VN實驗能檢測動物感染的病毒類型。VN檢測需要兩個或多個重復，CSFV中和抗體的效價要與BVDV、BDV參考毒株的中和抗體效價進行比較，效價差別4倍或以上可以認為是最高中和抗體效價的病毒感染(Anonymous，2002)。這種方法通常用于疾病爆發(fā)豬場周圍其它豬場控制措施解除前的檢測。
ELISA方法可用于流行病學調查，監(jiān)測無CSFV區(qū)域非常實用。競爭ELISA是建立在用抗CSFV血清與針對于CSF E2蛋白的特異性單克隆抗體基礎上，利用競爭ELISA可以減少與其它瘟病毒抗體的交叉反應，常用的包被抗原是用昆蟲桿狀病毒表達的E2(gp55)抗原。CSFV感染后10-15天可用ELISA檢測到抗體，這與中和抗體出現(xiàn)的時間相似。
Erns（rns應為上標）‐ELISAs被開發(fā)為用于E2亞單位疫苗接種群體的差異對照試驗。近年來，其它Erns（rns應為上標）‐ELISAs已被開發(fā)用作為ELISA對照(Aebischer et al.2013)。然而在建議將其作為與新標記嵌合疫苗CP7-E2Alf的鑒別診斷的對照試驗前，作為商業(yè)性ELISAs仍有改進空間(Schroeder et al.2012)。
免疫
盡管CSFV能引起免疫抑制，但豬只感染恢復后能產(chǎn)生中和抗體。中和抗體由囊膜糖蛋白E2產(chǎn)生，囊膜蛋白Erns （rns應為上標）和非結構蛋白N能誘導非中和抗體的產(chǎn)生。在感染病毒后10-20天，中和抗體可以清除病毒。
CSFV特異性中和抗體和特異性殺傷細胞是重要的免疫應答反應(Renson et al.2014)。細胞免疫和中和抗體的雙組合可以提供快速、完全的保護，將病毒清除。但是每一種免疫反應均具有避免CSFV引起的致命感染的效果。E2亞單位疫苗能誘導高水平的中和抗體保護豬只(Bouma et al.1999)，也能保護相關瘟病毒或嵌合病毒的實驗室感染，但未檢測到針對這些病毒的中和抗體(Reimann et al. 2004; Voigt et al.2007)。
已免疫或者感染過的豬對病毒的再次感染有一定的抵抗力。CSFV是相對穩(wěn)定的RNA病毒，并且在不同毒株間甚至BVDV和CSFV間都存在交叉保護(Leforban et al.1992) 。仔豬的母源抗體保護力能持續(xù)8-12周，這主要取決于初乳中的中和抗體水平(Kaden and Lange，2004)，但同時也能干擾疫苗免疫反應(Vandeputte et al.2001)。
預防和控制
豬瘟是一種全球性流行疫病，盡管一些地區(qū)已經(jīng)根除，但在根除和流行區(qū)域的邊界及一些野豬群中仍然存在(Laddomada，2000)。根除區(qū)域再次感染CSFV的風險依舊很高，根除地區(qū)的生產(chǎn)者和獸醫(yī)在檢測CSFV的爆發(fā)中發(fā)揮了重要作用，但是早期檢測需要預警和對臨床癥狀等進行培訓。
為了滿足國際貿易需求，無CSFV地區(qū)采取不免疫政策，即通過銷毀被感染或者可疑豬群及實施檢測來控制豬瘟(Anonymous，2001)。歐洲在根除豬瘟后也重申不免疫，這種做法尤其適合養(yǎng)豬密度高的地區(qū)。因為這些地區(qū)存在很多增加該病傳播風險的因素(Koenen et al.1996; Mintiens et al. 2003)。在某些情況下，像1997年荷蘭爆發(fā)豬瘟，限制屠宰豬只轉移，避免了大量動物被安樂死。疫苗接種區(qū)至少一年禁止國際貿易，因此疫苗的使用影響了經(jīng)濟效益，但是面對豬瘟爆發(fā)，將來還是要考慮疫苗緊急接種。
目前有很多可供選擇使用的豬瘟疫苗，包括著名的中國C株、Thiverval株，新型能用于區(qū)分野毒和疫苗毒的標記疫苗(Blome et al.2017)。傳統(tǒng)的活疫苗能夠產(chǎn)生高水平的保護力，并在免疫2周后產(chǎn)生中和抗體(Dahle and Liess，1995)。免疫間隔達6-10個月，免疫途徑（肌肉或口服）影響不大(Kaden and Lange，2001; Kaden et al.2008)。弱毒活疫苗最大的缺點是不能與野毒感染所產(chǎn)生的抗體進行區(qū)分。
商品化的重組E2亞單位疫苗提供了一種區(qū)分疫苗免疫動物的方法。已經(jīng)進行了E2標記疫苗的免疫攻毒和傳播實驗的效果評估，但效果不一。單次免疫3周后接種CSFV能防止臨床癥狀的發(fā)生并降低死亡率(Bouma et al.1999)，免疫后至少需要2周時間才能提供臨床保護(Bouma et al.2000; Uttenthal et al.2001)。免疫后攻毒過早，疫苗不能提供臨床保護，也不能減少病毒的攜帶量(Uttenthal et al.2001)。
E2標記疫苗的效果評估顯示，即使免疫2次，在第二次免疫后14天用CSFV攻毒，病毒仍可通過胎盤屏障，通過2次疫苗免疫能防止妊娠母豬出現(xiàn)臨床癥狀，但不能阻止CSFV的水平和垂直傳播(Dewulf et al.2001b)。因此，在多數(shù)緊急免疫時，免疫動物不能阻止CSFV通過胎盤感染，疫苗不能控制“帶毒母豬綜合征”，最終導致豬瘟的遲發(fā)性感染。
目前，構建以遺傳工程為基礎的CSF疫苗研發(fā)為主要方向，有5個策略：CSFV免疫多肽、DNA疫苗、表達CSFV蛋白的病毒載體疫苗、嵌合瘟病毒和反向轉錄缺失CSF基因（復制子）(Blome et al. 2017)。嵌合性瘟病毒CP7-E2Alf在被廣泛評估其安全性和效力后獲得許可(Gabriel et al.2012)。無論何種途徑接種(口服還是肌肉注射)，它都能誘導產(chǎn)生良好的免疫保護，防止病毒進一步傳播，在育肥豬和妊娠母豬中也很安全。母源抗體(Eble et al.2014)或BVDV-1抗體(Drager et al.2016)似乎不會顯著干擾疫苗的效果。該疫苗可用于緊急接種，以控制豬瘟在家豬或野豬中的傳播。如果有一個完全有效的配套工具包，其DIVA疫苗是一個非常有價值的工具，控制疫情，同時進行血清學監(jiān)測。
野豬豬瘟
野豬是CSFV的潛在宿主，大部分家豬爆發(fā)豬瘟可歸結于野豬的傳播(52%，F(xiàn)ritzemeier et al. 2000)。因此，自上世紀90年代以來，為限制CSFV在野豬群中的廣泛傳播，歐盟成功地實施了大規(guī)?？诜柏i疫苗(Rossi et al.2015)。CSFV感染對野豬似乎是無害的，因為在過去的爆發(fā)中很少有死亡報告。在自然或人為屏障存在的情況下，野豬種群中的CSFV可以被限制在一個特定的區(qū)域內，直到最終被消除(Pol et al.2008)。
控制野豬CSFV的經(jīng)典措施包括減少狩獵，使病毒在易感群體中傳播，并導致死亡或免疫，然后對最易感動物(幼豬和幼母豬)進行有針對性的狩獵。在一些難以用標準方法根除CSFV的地區(qū)，已經(jīng)嘗試使用混合在口服誘餌中的C株口服活疫苗接種(Kaden等，2000)。該疫苗的安全性已在其它野生動物中得到證實(Chenut et al.1999)。
口服疫苗可在10天內誘導豬只產(chǎn)生較強的保護性免疫(Kaden and Lange，2001)。然而最近對口服疫苗野外接種數(shù)據(jù)分析表明，需3倍劑量的口服疫苗才能對野豬提供足夠的保護力。大多數(shù)研究表明，由于難以獲得誘餌，幼齡豬沒有獲得足夠的保護性免疫(Kaden et al.2002)。如果將疫苗用于預防，并在病毒進入該地區(qū)前至少一年進行接種，則疫苗接種似乎更有效，從而為實現(xiàn)高水平的群體免疫提供了時間。為預防疾病的傳播，建議在疫情爆發(fā)前進行常規(guī)疫苗接種(Rossi等，2010年)。
使用疫苗后，能區(qū)分野毒和疫苗免疫野豬的唯一方法是通過DIVA qRT‐PCR檢測 (Leifer等，2009)。因此，很難決策何時停止接種疫苗。CSFV抗體可持續(xù)多年，并在大規(guī)模口服疫苗免疫后進行監(jiān)測。因此，建議加強陽性監(jiān)測，以便發(fā)現(xiàn)病死野豬。然而，由于在自然界中很少發(fā)現(xiàn)尸體，因此建議結合對幼畜的血清學監(jiān)測和數(shù)據(jù)建模，以確定幼畜血清價超過5%為預警點。在這些地域，應實施有針對性的血清學和病毒學監(jiān)測(Saubusse et al.2016)。在未來，口服DIVA疫苗是很有價值的，通過血清學監(jiān)測及時發(fā)現(xiàn)野毒的傳播。嵌合性瘟病毒CP7-E2alf是目前最有希望用于口服的候選活疫苗。
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Peter D. Kirkland, Marie‐Frédérique Le Potier, and Deborah Finlaison（著）
李明明 郭海榮（譯）/徐大為（校）